综述分享：单细胞T细胞受体测序技术
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在开篇推文中我们对T细胞受体（T cell receptor, TCR）的结构进行了详细介绍，但是要想深入探讨TCR的生物学意义，需要鉴定人体内大量的TCR谱数据。随着高通量测序技术的发展，TCR测序大规模检索细胞中的TCR序列信息已经成为现实。为了对TCR测序有更深的了解，在这里舒桐小编给大家分享斯坦福大学医学院Ansuman T. Satpathy教授团队发表于Nature Methods（IF = 28.547）上的一篇关于TCR测序技术进展的综述[1]。
研究背景
01
T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面负责特异性识别与主要组织相容性复合体（MHC）结合的抗原肽的蛋白，其序列可作为T细胞克隆的独特识别标志。TCR序列信息获取方法主要经历了三个发展阶段。早期的TCR序列信息获取，以CDR3谱型分析和利用TRBV单克隆抗体的流式细胞术为代表，该方法能够揭示TCR库的基本特征，但只是获取部分序列信息。随着基因组测序技术的兴起，通过分子克隆和Sanger测序能够在核苷酸分辨率水平捕获TCR信息，可更精确的评价CDR3多样性，但该阶段只能对少量TCR进行测序。二代测序技术在过去二十年中发展迅速并逐渐普及，TCR检测的灵敏度和TCR发现工具性能得到极大提升，通过二代测序技术对TCR进行测序已成为当下的主流趋势。
图1 利用TCR多组学测序方法刻画T细胞动态
基于二代测序的TCR测序进展
02
一
TCR测序的分子策略
使用高通量测序技术对TCR库进行测序，可以实现在一次实验中同时对数以百万计的T细胞（图1a）进行TCR测序。这些方法通常采用以下两种靶向扩增策略：（1）多重PCR；（2）5’互补端快速扩增（5’RACE）。
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多重PCR
由于TCR V基因巨大的多样性，一对引物不足以捕获所有的TCR转录本，所以出现了多重PCR反应。多重PCR方法使用一组与已知V基因互补的正向引物和一组与J或C区域互补的反向引物。在这种引物扩增策略中，首先从T细胞中分离gDNA或RNA，然后采用上述引物对进行多轮PCR扩增，这些引物同时含有用于后续高通量测序的通用序列。此种依赖于多重PCR扩增的方法会引入测序偏好和错误，从而无法获得TCR多样性的真实情况。目前有几种策略用于减小这种偏好，例如，由于cDNA转录本已经是经过剪切的，所以使用mRNA可以采用更少的反向引物以靶向C区域，从而降低来自多重J引物PCR扩增的偏好性。相反，采用gDNA测序能够避免反转录，从而降低在cDNA合成过程中引入错误的可能。
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5’ RACE
第二种TCR测序方法是基于5’ RACE，这种方法需要使用具有末端转移酶活性的逆转录酶反转录RNA，从而在cDNA的3’端加入非模板C寡核苷酸，用于下游的cDNA扩增，非模板C寡核苷酸叫做模板转换寡核苷酸（Template switch oligo，TSO）。在第一链合成过程中，当到达RNA模板的5'末端时，逆转录酶的末端转移酶活性会在新合成的cDNA链的3'末端添加一些额外的核苷酸。这些碱基充当模板转换(TS)寡核苷酸锚定位点。在TS寡核苷酸和附加的脱氧胞苷片段之间进行碱基配对后，逆转录酶“转换”模板链，从细胞RNA到TS寡核苷酸，并继续复制到TS寡核苷酸的5'端。这种方法可以得到包含完整5'端的cDNA，意味着可以保留完整的V基因序列。
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多重PCR与5’ RACE测序方法的比较
由于TCR库测序方法不同，所以在分析测序结果时应考虑以下几个因素：首先，是采用DNA还是RNA，这决定了可以使用哪种测序方法。上述两种方法均可用于RNA，然而，如果RNA质量欠佳，则gDNA多重扩增法则可能是更好地选择。其次，TCR测序的目的也会影响测序方法的选择。例如，RNA测序结果无法直接与细胞数目相关联。所以，如果研究目标是定量某个T细胞群的克隆扩增，则gDNA法是更好的选择，因为每个细胞只有一个TCR基因组拷贝。类似地，由于多重PCR使用靶向V基因不同区域的多组引物，所以基本无法获取跨越整个V（D）J区域的全长TCR序列，这种方法足以分析具有最高变异程度的CDR3区，然而，如果拟回答的生物学问题需要评价CDR1和CDR2等其他区域，则5’ RACE法更为合适。
以上方法均是基于细胞群体的TCR库测序，然而，这种基于细胞群体的TCR库测序方法无法分辨配对的TCRα和TCRβ，因为一次只能获取一条链。由于TCR是以二聚体的形式识别抗原的，所以这种方法限制了抗原特异性的评价。此外，TCRαβ克隆型分析更加准确，因为相同的TCRβ序列可能与不同的TCRα序列配对。所以，只考虑一条链可能低估TCR多样性、混淆克隆内表型分析以及无法准确识别免疫反应相关T细胞抗原特异性。
二
配对TCRαβ的高通量测序方法
捕获配对TCRαβ测序能够更加准确地分辨TCR库中的克隆结构、评价TCR功能以及抗原特异性。捕获配对TCRαβ测序可通过两种途径实现：（1）采用基于组合的策略计算推断TCRαβ配对；（2）采用分离的单细胞进行TCRα和TCRβ同时测序。
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组合推断TCRαβ配对
第一种基于组合策略计算推断TCRαβ配对的方法称为pairSEQ。在这种方法中，T细胞随机分布于96孔板中，每个孔含有带有相同DNA barcode的一群细胞（图2a）。收集所有样本测序，将带有相同barcode的TCRα和TCRβ序列进行计算匹配并确认配对，由于TCR重排的高度多样性，出现带有相同barcode的两个克隆的可能性极低。这种基于频率的配对方法的缺点是只有扩增克隆可以被检测配对，所以不适合发现罕见TCRαβ序列。
图2 单细胞TCR测序方法
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单细胞TCR测序技术
单细胞分离技术的进步使获得配对TCRαβ链信息成为可能。早期的单细胞配对TCRαβ分析方法依赖于通过显微操作分离单个T细胞，再进行多重PCR和Sanger测序，然而这类方法耗时且效率和通量受限。目前，普遍采用的分离单细胞方法是采用荧光激活细胞分选技术（FACS）（图2a）。这种方法的优势是可以对感兴趣的细胞类群基于细胞表面分子标志物进行富集测序，而不用对样本中所有T细胞进行测序，这有助于分析罕见细胞亚群。此外，该方法可保证较高的测序质量和测序深度，从而产生更可信的TCR序列，这对于分析克隆多样性非常重要。在这种方法中，根据各种细胞表面不同蛋白结合不同荧光抗体并被单独分选至微滴孔板中，可以一次性分离数百个单细胞。然后，TCR链被逆转录并采用多重PCR法进行靶向扩增。
另一种单细胞配对TCRαβ测序策略是基于细胞的乳化PCR方法。这类方法中，单细胞被捕获在油包水的乳化液滴中，其中含有TCR引物和RT-PCR试剂，经过OE-PCR（overlap extension RT-PCR）将TCRα和TCRβ转录本连接起来，然后融合的TCRαβ转录本进行富集、扩增和测序（图2b）。这种方法可以对所有的T细胞进行测序，有助于研究人员对T细胞的来源与动态状态进行分析。
三
利用单细胞TCR测序识别T细胞状态及功能
在单细胞水平上获取TCR序列信息是一大技术进步，进一步研究特定细胞状态下的TCR库能够提供更加全面探究T细胞免疫反应的功能和生理信息。目前已有多种将TCR测序与其他组学方法进行整合的分析方法被开发出来（图1b-d）用于将TCR与T细胞表型进行配对，主要通过以下两种途径实现：（1）单细胞测序（scRNA-seq）数据计算重构TCR链；（2）scRNA-seq数据联合特异性扩增TCR位点（图3）。
图3 配对scRNA-seq和TCR测序方法概览
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单细胞测序数据计算重构TCR链
从scRNA-seq数据提取TCR信息的计算方法通常依赖于结合比对和重头组装步骤来确认TCR来源的reads并重构TCR链（图3c）。利用已知scRNA-seq方法进行TCR重构的一大挑战在于，依赖于扩增3’端转录本的方法不会捕获V（D）J所在的5’端。为了解决这个问题，研究者开发出利用全长cDNA扩增和测序的新方法，这种方法中，利用类似于5’RACE的模板转换机制来进行单个细胞的逆转录（图3b）。在片段化和测序后，单个TCR序列被计算重构并在其特定表型谱中进行分析。目前用于TCR重构的算法主要包括scTCRseq、TraCeR、VDJPuzzle以及TRAPeS等（图3c）。通过结合TCR序列和基因表达谱，这些计算方法提供了T细胞克隆表型动态的初步景观。
舒桐科技可提供TCR序列重构服务，利用算法对TCR中的CDR3序列进行提取，帮助客户充分挖掘scRNA-seq数据，并对T细胞克隆性和多样性进行生物学解释。Tips：5’和3’端scRNA-seq数据均可用于TCR序列重构，但5’端数据TCR重构效果要优于3’端，建议提供5’端数据。
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单细胞测序联合特异性扩增TCR位点
为了获得更高覆盖度的TCR测序文库，单细胞中RNA谱与靶向TCR双链扩增进行结合的方法也被开发了出来（图3a）。主要包括InDrop法（图3a，红线）、利用生物素标记的寡核苷酸探针比对到C区域的方法（图3a，紫线）以及RAGE-seq法（图3a，绿线），这些方法均采用捕获全长TCR测序，然而，由于nanopore测序的高错误率和多重测序需求，这些方法TCR回收率较低，并限制了广泛使用。
此外，采用5’ RNA扩增同时进行scRNA-seq和TCR测序的方法也被开发出来。在这种方法中，与3’ 端scRNA-seq类似，细胞被包裹在含有barcode beads的液滴中，然而，与3’ 端scRNA-seq不同的是，barcode添加在与TSO相邻的cDNA 5’ 端（图3a，蓝线）。全长cDNA被富集并采用通用引物进行逆转录。将cDNA分为两部分，一部分用来进行TCR转录本靶向富集并比对至TCR恒定区，另一部分直接用于构建基因表达文库，通过此方法可以把TCR信息与RNA表达谱根据barcode信息联系起来。这种5’ 端捕获方法被10x Genomics商业化并进一步加深了对于T细胞反应特性的理解，尤其在癌症研究中。Azizi等[2]分析了人类乳腺癌肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）组成，以考察TCR库多样性与T细胞表型多样性的关系。整合细胞状态和TCR克隆型数据可揭示T细胞激活的连续轨迹，这可部分用TCR多样性来解释。此外，作者发现T细胞克隆主要集中于表型相关的细胞亚群，这些亚群表达相似的特征，比如失能和糖异生，这表明细胞状态很大程度上由TCR刺激和环境因素所决定。
四
展望
scRNA-seq和TCR测序结合起来能够帮助我们更细致地理解T细胞的发育轨迹和表型可塑性。然而这些方法在应用于生理环境，譬如人类组织之前需要多次迭代，每一次进步无疑会使我们更好地理解机体如何协调T细胞反应的机制，进而帮助我们开发更好的癌症、感染以及免疫相关疾病治疗策略。
舒桐科技是国内领先的基因编辑服务提供商，可提供TCR测序级数据分析、sgRNA设计、扩增子测序及基因编辑效率分析等服务。如有需求，欢迎咨询！
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参考文献
[1] Pai JA, Satpathy AT. High-throughput and single-cell T cell receptor sequencing technologies. Nat Methods. 2021;18(8):881-892. doi:10.1038/s41592-021-01201-8
[2] Azizi E, Carr AJ, Plitas G, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell. 2018;174(5):1293-1308.e36. doi:10.1016/j.cell.2018.05.060